基因扩增仪，即实时监测PCR扩增产物并进行解析的方法，它是在PCR反应体系中加入荧光物质，并通过PCR检测系统对PCR反应进程中的荧光信号强度进行实时监测，最终对实验数据进行分析处理的方法。描述 PCR动态进程的曲线即扩增曲线。它实际上并不是一条标准的指数曲线，而是S形曲线，这是因为随着 PCR循环数的增加DNA聚合酶的失活,dNTP和引物的枯竭，反映副产物焦磷酸对合成反应的阻害等原因，致使PCR并非一直呈指数扩增，而最终将进入平 台期。由于影响PCR扩增的因素错综复杂，因此每次PCR扩增时进入平台期的时机及信号高低变化很大，很难精确控制。尽管平台期的变化很大，但在扩增曲线 的指数增长区的某一区域，重复性非常好，这对PCR的定量分析非常重要，如果在扩增曲线的指数增长区适当位置设定荧光检出界限值即阈值 （threshold）就会得到阈值与扩增曲线的交点Ct值，Ct值是指达到阈值时的循环圈数（threshold cycle），Ct值与起始模板数的对数值成反比线性关系。

　　操作基因扩增仪时需要注意的问题:

　　PCR引物设计:

　　引物设计可能是PCR扩增成功最关键的因素。如引物设计欠佳，可能导致扩增产物不足，甚至扩增失败，其原因是设计欠佳的引物可导致非特异扩增和/或形成引物二聚体，此又成为PCR反应的竞争性产物，从而进一步抑制PCR产物形成。

　　在引物设计时必须考虑以下几个因素，其中最重要的是引物长度、溶解温度(Tm)、特异性、引物序列互补问题、G/C 含量和多嘧啶(T,C) 或多嘌呤(A, G)延伸、3’-末端序列等。

　　(1)引物长度:由于PCR反应的特异性、退火温度以及时间均至少部分与PCR引物长度相关联，因此引物长度是PCR扩增是否成功关键的因素。一般PCR引物长度为15-30核苷酸。

　　(2)溶解温度(Tm):因加热而断开H键，使双链DNA分开或“溶解”为单链DNA。溶解温度(Tm)即指使一半双链DNA变为单链DNA的温度。Tm可采用下列公式计算:Tm＝2(A+T) + 4(G+C)。

　　(3)引物序列互补:设计引物时应绝对没有3个碱基以上的内引物配对，如引物有这样具有自我配对的区域，“弹回”即部分双链结构将发生在退火反应时。

　　(4)G/C 含量和多嘧啶(T,C) 或多嘌呤(A, G)延伸:待选择的引物序列应尽可能是碱基随意分布，G+C含量平均-避免长A+T和富含G+C的区域。在引物的碱基组成中GC含量一般为45％-55％。在选择的引物序列中应没有多G 或多C延伸，因其可促进非特异性退火，多A 和多T延伸也应避免，因其可“呼吸”和使引物－模板复合物展开延伸，降低扩增的效率。同时多嘧啶(T,C)和多嘌呤(A,G)延伸也应被避免。

　　(5)3’-末端序列:为控制引物错配，应认真地确定PCR引物中3’末端的位置。

　　总而言之，应重视PCR引物设计，设计PCR引物时应认真小心。对于一个成功的PCR来说，几个重要因素如引物长度、GC含量和3’序列必须优化。理想的引物应为差不多随意分布的核苷酸混合、GC含量50％、长度约为20个碱基，因此能使Tm值处于56-62ºC范围。分析靶基因潜在引物位点时，应考虑无单聚合体, 没有明显的二级结构形成的倾向，不自我互补，与其他双链靶基因序列没有明显的同源性。为避免枯燥无味的设计，节省时间，减少错误，可应用计算机程序优化设计、选择、确定寡核苷酸引物。