梯度PCR介绍实时荧光定量 PCR技术原理与应用

　　聚合酶链式反应 ( PCR) 可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增 。在扩增反应结束之后，我们可以

　　通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，也可以通过 放射性核素掺入标记后的光密度扫描来

　　进行定量的分析 。无论定性还是定量分析，分析的都是 PCR 终产物。但是在许多情况下，我们所感兴

　　趣的是未经 PCR 信号放大之前的起始模板量。例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者

　　某一特定基因在特定组织中的表达量。在这种需求下荧光定量 PCR 技术应运而生。所谓的实时荧光定

　　量 PCR 就是 通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及

　　定性的分析。在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行， PCR

　　反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们

　　就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。

　　一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段:荧光背景信号阶段 , 荧光信号指数扩增阶段

　　和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化

　　。而在平台期，扩增产物已不再呈指数 级的增加。 PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，

　　所以根据最终的 PCR 产物量不能计算出起始 DNA 拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段， PCR 产物

　　量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较

　　的方便，在实时荧光定量 PCR 技术中引入了两个非常重要的概念:荧光阈值和 CT 值。荧光阈值是在

　　荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧

　　光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。每个反应管内的荧光信号到达设定

　　的域值时所经历的循环数被称为 CT 值（ threshold value ）。