1、实验准备

　　1.1  培养基、TSA(加中和剂) 接触碟。

　　1.2  阳性对照:试验菌株金-黄色葡萄球菌

　　1.3  仪器:无菌检查电脑集菌仪、光学成像显微镜、全自动微生物鉴定仪、电热恒温 培养箱、生物安全柜。

　　1.4  主要试剂及耗材:灭菌蛋白胨溶液、无菌绿化钠-蛋白胨缓冲液、革兰染色液。

　　2、 监测流程

　　洁净室环境及人员监测  对乙型脑炎减毒活疫苗生产操作洁净室进行浮游菌、沉降菌和设施设备及人员表面微生物动态监测，C级每周一次，D级每月一次。

　　2.1  表面微生物测试: 采用接触碟法，即TSA(加中和剂)培养基充满碟子并形成圆弧顶，取样面积为25cm2，取样时打开碟盖，无菌培养基表面与取样面直接接触， 均匀按压接触碟底板10s左右，确保培养基表面与取样点表面均匀充分接触，再盖上碟盖然后将采样后平皿先倒置于20～25℃恒温培养箱(室)中培养3d进行菌落计数，再倒置30～35℃恒温培养箱(室)中培养2～3d进行菌落计数并判定结果。

　　2.2  菌型分析 采用菌落形态特征观察、革兰染色镜检以及使用全自动微生物鉴定仪对以上所获的微生物进行鉴定分析

　　3、结果分析

　　2012 年1月至12月洁净区环境微生物检测包括浮游菌沉降菌设施设备及人员表面微生物检测，菌型分析统计结果见下表:

　　微生物类别         名称                           累计次数      比例（%）

　　G+               人葡萄球菌                         214          28.50

　　G+               表皮葡萄球菌                       142          18.90

　　G+               里格/藤黄微球菌                    234          31.16

　　G+       科式葡萄球菌科氏亚种                   27           3.60

　　G+             玫瑰色库克菌                         15           2.00

　　G+             克氏库克菌                           10           1.33

　　G+              蜡样芽孢杆菌                         83           11.05

　　G+      坚强芽孢杆菌                             3           0.40

　　G+             少动鞘氨醇单胞菌                      7            0.97

　　G-             嗜麦芽寡养单胞                        2            0.27

　　G-            产吲哚金黄杆菌/缺陷短单胞菌/泡短波单胞菌 1         0.13

　　G-            地衣芽胞杆菌                           1             0.13 

　　G+            多粘类芽胞杆菌                         1             0.13

　　G+            木糖无色杆菌                           1             0.13

　　G+           脂环酸芽胞杆菌                          1             0.13

　　-           霉菌                                   9             1.20

　　4、 讨论

　　从菌型分析结果统计可知，该洁净区环境和人员主要存在革兰阳性球菌，如里拉/藤黄微球菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌等，共占78.56%以上,其次为蜡样芽胞杆菌和少量的库克菌及霉菌等另外，对于霉菌从检测时间和空间上看,主要集中出现在春夏季节，洁净区较潮湿的精洗场和细胞水浴加温洁净室因此宜在春夏季节加强工艺湿度较大洁净室霉菌的消杀处理。